北京治疗白癜风多少钱一次 https://jbk.39.net/yiyuanfengcai/zn_bjzkbdfyy/摘要：目的研究熊果酸通过经典Hedgehog信号通路影响人结直肠癌SW细胞增殖和凋亡的作用及其机制。方法通过显微镜观察熊果酸对SW细胞形态的影响；采用MTT比色法检测熊果酸对细胞活力的影响；细胞划痕实验检测熊果酸对细胞迁移的影响；Hoechest/PI染色法观察熊果酸对细胞凋亡的影响；荧光探针法检测熊果酸对细胞线粒体膜电位的影响；Caspase活性检测试剂盒检测熊果酸对细胞凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-9的影响；蛋白免疫印迹法检测Hedgehog信号通路相关蛋白SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc、SuFu及细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平。结果SW细胞经熊果酸给药后形态发生改变；细胞迁移能力显著下降；线粒体膜电位降低；细胞核出现致密浓染；Caspase-3、Caspase-9活性升高；SW细胞发生凋亡；Hedgehog信号通路相关蛋白SuFu的表达水平升高，SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc的表达水平下降；细胞凋亡相关蛋白Bax的表达水平升高，Bcl-2的表达水平下降。结论熊果酸对SW细胞的生长、增殖具有抑制作用，通过抑制Hedgehog信号通路的激活促进SW细胞凋亡。
随着现代生活水平的提高，结直肠癌的发病率逐年上升，其中在发达国家上升趋势尤为显著。结直肠癌常见于老年群体，但近年来逐渐趋向年轻化，在年轻人中的死亡率逐年上升[1-2]。临床治疗结直肠癌的方法包括手术、放疗、化疗等，现代治疗多根据结直肠癌靶点、异质性和耐药性等特点采取广谱疗法。目前结直肠癌临床治疗的常用药物如贝伐单抗、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂等都已有较为深入的开发和应用[3-5]，尽管国内外均对结直肠癌的预防和治疗有大量的研究报道，为临床众多结直肠癌患者带来福音，但对其分子机制和治疗靶点的研究有待深入。
熊果酸是一类具有显著生物活性的五环三萜类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜中，同时也是中药材白花蛇舌草、冬凌草、木瓜、夏枯草等的主要活性成分[6-9]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病*、抗诱变等药理活性[10-11]。目前已有大量关于熊果酸抗癌机制报道，包括结直肠癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、皮肤癌[12-16]等。Hedgehog信号通路近年来被发现参与多种肿瘤的发生、发展、转移和耐药性阶段[17]，然而未见有关于熊果酸通过Hedgehog信号通路抑制结直肠癌的研究，因此本研究以人结直肠肿瘤SW细胞为模型，检测熊果酸对细胞生长、增殖、迁移及细胞凋亡方面的影响，初步探索熊果酸通过Hedgehog信号通路对结直肠癌的作用效果，为临床结直肠癌的治疗提供更多的用药选择和实验数据基础。
1材料
1.1细胞与药物
人结直肠癌SW细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所；熊果酸（质量分数＞98%，批号MUST-），购自成都曼斯特生物科技有限公司，Hedgehog信号通路抑制剂GANT-61（C27H35N5，质量分数＞98%，批号#），购自美国MedChemExpress（MCE）公司。
1.2试剂
DMEM低糖细胞培养基（批号SLBT），美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液（PBS，批号D）、胰蛋白酶（批号HJ）、青霉素链霉素双抗（批号HJ），索莱宝科技有限公司；胎牛血清（批号），赛澳美细胞技术有限公司；抗荧光淬灭封片液（含Hoechst和碘化丙啶（propidiumiodide，PI，批号818191028）、线粒体膜电位检测试剂盒（批号）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号P）、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（批号P）、MTT试剂盒（批号C-2）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性检测试剂盒（批号）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-9）活性检测试剂盒（批号），碧云天科技有限公司；Hedgehog信号通路相关抗体、音猬因子（sonichedgehog，SHh）、GLI家族锌指蛋白1（GLIfamilyzincfingerprotein1，Gli1）、G蛋白偶联受体蛋白（smoothened，Smo）、原癌基因蛋白（cellular-myelocytomatosisviraloncogene，c-Myc）、苏氨酸蛋白激酶Fused抑制因子（suppressorofFused，SuFu），武汉三鹰生物技术有限公司；表面受体（Patched，Ptch1），美国Immunoway公司。细胞凋亡相关抗体：B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-celllymphoma-2，Bcl-2），美国Immunoway公司；Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax），武汉三鹰生物技术有限公司。内参抗体：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、山羊抗兔IgG二抗，杭州联科生物技术股份有限公司。
1.3仪器
多功能酶标仪（美国Thermo公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；DMIB倒置显微镜、SP8SR激光共聚焦显微镜（德国Leica公司）；QUOTQTION电泳仪、化学发光凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）FormaCO2培养箱（美国Thermo公司）；AllegraX?-12series离心机（美国BECKMANCoulter）；CYT5MFV微孔板成像系统（美国BioTek公司）。
2方法
2.1细胞培养
SW细胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的DMEM培养基培养，放置于37℃、5%CO2的环境中。根据细胞生长情况，2～3d更换新鲜培养基，待细胞生长面积达80%～90%时，按1∶2比例进行传代，传至第5代后部分用于保存，部分用于后续实验。
2.2光学显微镜下观察细胞生长、细胞形态
取出处于对数生长期的SW细胞，经胰蛋白酶消化并收集细胞后，以1.0×个/mL的细胞密度，μL/孔的体积接种于24孔细胞培养板中，培养12h待细胞贴壁后，对照组更换含0.1%二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、给药组更换含不同浓度（5、10、20μmol/L）熊果酸、阳性药组更换GANT-61（20μmol/L）的培养基（μL/孔）处理细胞，继续培养24h后，于微孔板成像系统中观察记录细胞生长情况和细胞形态。
2.3MTT比色法检测细胞增殖
采用“2.2”项方法处理细胞，以1.0×个/mL的细胞密度，μL/孔的体积接种于96孔细胞培养板中，培养12h待细胞贴壁后，对照组更换含0.1%DMSO、给药组更换含不同浓度（5、10、20、40、60、80、、、μmol/L）熊果酸的培养基（μL/孔）处理细胞，继续培养24h后，更换含5mg/mLMTT的培养基（μL/孔）处理细胞，继续培养24h后，更换含5mg/mLMTT的培养基（μL/孔）处理细胞，继续培养4h后，更换DMSO（μL/孔）处理细胞结晶，振荡10～15min，待结晶物充分溶解后，在酶标仪中测定波长nm下的吸光度（A）值，并计算细胞存活率。
细胞存活率＝A药物/A对照
2.4划痕实验检测细胞迁移能力
采用“2.2”项方法处理细胞，以1.0×个/mL的细胞密度，μL/孔的体积接种于24孔细胞培养板中，培养12h待细胞高密度贴壁后，手持移液器，使枪尖垂直于培养板底部，水平划线。然后对照组更换含0.1%DMSO、给药组更换含不同浓度（5、10、20μmol/L）熊果酸、阳性药组更换含GANT-61（20μmol/L）的培养基（μL/孔）处理细胞，在加药后0、12、24h时间点于显微镜下观察并记录细胞划痕的愈合情况。各组细胞不同时间点的划痕面积采用ImageJ软件统计，以对照组（0h）的划痕面积为基准，计算相对划痕面积。
2.5Hoechest/PI染色法观察细胞凋亡
在细胞发生凋亡的初期阶段，细胞膜还未破损，但细胞核染色质开始固缩，因此通过Hoechst/PI染色观察初期细胞凋亡。采用“2.2”项方法处理细胞，以1.0×个/mL的细胞密度，1mL/孔的体积接种于激光共聚焦培养皿中，培养12h，待细胞贴壁后，对照组更换含0.1%DMSO、给药组更换含不同浓度（5、10、20μmol/L）熊果酸、阳性药组更换含GANT-61（20μmol/L）的培养基（1mL/孔）处理细胞，继续培养24h后，吸弃培养基，PBS清洗后每孔加入50μL含Hoechst和PI的抗荧光淬灭封片液，然后于激光共聚焦显微镜下观察记录细胞凋亡情况。
2.6JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位
在细胞发生凋亡的早期阶段，线粒体膜电位会发生改变，因此通过检测线粒体膜电位的变化来考察细胞早期凋亡。采用“2.2”项方法处理细胞，以1.0×个/mL的细胞密度，μL/孔的体积接种24孔培养板于中，培养12h，待细胞贴壁后，对照组更换含0.1%DMSO、给药组更换含不同浓度（5、10、20μmol/L）熊果酸、阳性药组更换含GANT-61（20μmol/L）的培养基（μL/孔）处理细胞，继续培养24h后，收集细胞，按照线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）说明书染色，在微孔板成像系统下观察线粒体膜电位的变化。
2.7Caspase-3、Caspase-9活性的检测
采用“2.2”项方法处理细胞，以1.0×个/mL的细胞密度，1mL/孔的体积接种6孔培养板于中，培养12h，待细胞贴壁后，对照组更换含0.1%DMSO、给药组更换含不同浓度（5、10、20μmol/L）熊果酸、阳性药组更换含GANT-61（20μmol/L）的培养基（1mL/孔）处理细胞，继续培养24h后，收集细胞，每个样品加入μL裂解液，收集裂解液后部分采用Bradford法测定蛋白浓度，当蛋白质量浓度在1～3mg/mL时，剩余样品按照Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒设定反应体系，待体系颜色变化明显时在酶标仪中测定波长nm下的A值，并计算酶活力单位。
2.8蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达水平
采用“2.2”项方法处理细胞，以5.0×个/mL的细胞密度，1mL/孔的体积接种于6孔培养板中，培养12h，待细胞贴壁后，对照组更换含0.1%DMSO、给药组更换含不同浓度（5、10、20μmol/L）熊果酸、阳性药组更换含GANT-61（20μmol/L）的培养基（1mL/孔）处理细胞，继续培养24h后，收集细胞，每个样品加入μL预冷的增强型RIPA裂解液，收集裂解液后部分采用二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）法测定蛋白浓度，剩余部分按4∶1加入5×蛋白上样缓冲液，混匀后加热制样以备用。制备10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝胶，分离蛋白样品，湿法转膜，5%牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）室温封闭90min，按比例加入相应一抗后于4℃孵育过夜，次日更换二抗孵育90min，使用化学发光成像系统成像，采用ImageLab软件进行蛋白条带分析。
2.9统计学处理
除特别说明外，所有实验均进行≥3次的生物学重复研究，数据以形式表示。采用GraphPadPrism8.0（GraphpadSoftware，Inc）软件进行统计学分析，组间差异分析采用单因素方差分析法（One-wayANOVA）。
3结果
3.1对SW细胞形态的影响
微孔板成像系统明场模式下记录的SW细胞形态见图1，与对照组相比，SW细胞经熊果酸和Hedgehog信号通路抑制剂GANT-61给药处理后，细胞贴壁能力降低，形态发生明显改变，逐渐皱缩变圆，且随着熊果酸浓度的增加，细胞皱缩和碎片化的比例增加。
3.2对SW细胞增殖的影响
MTT比色法检测熊果酸对SW细胞增殖的影响，结果见图2，与对照组（0μmol/L）相比，在40μmol/L范围内，随着熊果酸浓度增加，细胞存活率急剧降低，当熊果酸浓度大于40μmol/L时，对SW细胞的存活率影响达到平稳阈值。通过分析得出熊果酸干预24h对SW细胞的半数抑制浓度（IC50）为18.16μmol/L，基于IC50，后续实验设定熊果酸对SW细胞的干预浓度为5、10、20μmol/L。
3.3对SW细胞迁移的影响
细胞划痕法检测熊果酸对SW细胞迁移的影响，结果见图3，与对照组及0h相比，熊果酸处理后12h和24h时间点的细胞划痕的愈合面积显著减小（P＜0.01、0.），说明熊果酸能够抑制SW细胞的迁移能力，且这种抑制作用随着熊果酸干预浓度的增加而增强。
3.4对SW细胞凋亡的影响
Hoechst/PI染色法观察熊果酸诱导SW细胞凋亡的情况，结果见图4，与对照组相比，熊果酸干预后细胞呈现凋亡早期染色质固缩所致的致密浓染，颜色过于饱和，甚至有些发白，表明熊果酸能够诱导SW细胞凋亡，这种诱导作用随着熊果酸干预浓度的增加而增强，值得注意的是，熊果酸高浓度（20μmol/L）处理诱导的细胞凋亡数量显著高于Hedgehog信号通路抑制剂GANT-61（20μmol/L）处理组。
3.5对SW细胞线粒体膜电位的影响
JC-1染色法观察熊果酸对SW细胞线粒体膜电位的影响，结果见图5，与对照组相比，熊果酸干预后细胞的红色荧光减弱，绿色荧光增强，表明熊果酸能使SW细胞的线粒体膜电位降低，且膜电位降低程度随着熊果酸干预浓度的增加而增大。
3.6对SW细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响
试剂盒检测熊果酸对SW细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响，结果见图6，与对照组相比，熊果酸各剂量干预后细胞的Caspase-3活性显著升高（P＜0.05），熊果酸高剂量干预后细胞的Caspase-9活性显著升高（P＜0.05），表明熊果酸能够增强SW细胞的Caspase-3、Caspase-9活性。
3.7对SW细胞凋亡相关蛋白的影响
蛋白免疫印迹法检测熊果酸对SW细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响，结果见图7，与对照组相比，熊果酸（20μmol/L）能显著升高SW细胞中促凋亡蛋白Bax表达量（P＜0.05），熊果酸各剂量均能显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达量（P＜0.05），表明熊果酸能够综合调控凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2水平，促进SW细胞发生凋亡。
3.8对SW细胞Hedgehog信号通路相关蛋白的影响
蛋白免疫印迹法检测熊果酸对SW细胞Hedgehog信号通路蛋白SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc、SuFu表达的影响，结果见图8，与对照组相比，熊果酸能显著降低SHh、Gli1、Ptch1、Smo、c-Myc蛋白的表达量（P＜0.05、0.01），显著升高SuFu蛋白的表达量（P＜0.05），表明熊果酸能够抑制Hedgehog信号通路的激活。
4讨论
作为世界3大癌症之一的结直肠癌，近年来随着饮食的精细化、高热量化和生活方式的久坐化、少运动化，结直肠癌的发病率和死亡率居高不下[18]。20世纪80年代，细胞凋亡开始作为癌症治疗的可行策略进入人们的视线，此后的30多年，人们一直致力于探索细胞凋亡在癌症治疗中的应用，促进肿瘤细胞凋亡不仅能保护正常细胞，死亡的肿瘤细胞还能促进临床反应，减少肿瘤复发的几率，未来靶向细胞凋亡作为癌症治疗的手段仍旧意义重大[19]。Hedgehog信号通路是癌症发生发展的重要信号通路SHh与Ptch1结合，Ptch1对Smo的抑制解除，Smo被激活释放，Smo激活是将SHh信号跨膜传递至细胞质的关键步骤，Smo激活后，SuFu与Gli1蛋白分离，Gli1释放出来，开始转录靶基因[20]，导致引起细胞分裂和修复受损DNA的原癌基因c-Myc表达水平上调[21]，此外SHh过表达和Gli1转录都能激活Bcl-2启动子，导致抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平上调[22-23]。熊果酸是中药白花蛇舌草的主要活性成分，《广西中药志》中记载白花蛇舌草：“治小儿疳积，*蛇咬伤，癌肿（肿瘤）”。此外熊果酸在抗肿瘤方面药效显著，对肠道、肺、肝、肾都具有良好的保护作用[24]。基于Hedgehog信号通路参与了肿瘤细胞的凋亡逃逸，因此，本实验将Hedgehog信号通路作为靶点，探索熊果酸通过Hedgehog信号通路抑制结直肠癌SW细胞增殖的机制。
本实验结果证明熊果酸对结直肠癌SW细胞具有良好的细胞*作用，在一定剂量范围内对细胞形态的影响显著，明显抑制细胞的生长、迁移，诱导细胞凋亡，其机制可能是通过抑制Hedghog信号通路的激活，使得Hedgehog信号通路中的关键因子SHh、Gli1和协助细胞规避凋亡的原癌基因c-Myc被抑制，凋亡蛋白家族Bcl-2表达下调，与仅含BH3区域蛋白（BH3-onlyproteins，BOPs）的结合减少，线粒体外膜开始产生孔隙，逐渐通透化，膜电位下降；Bax表达上调，转位到线粒体内部，释放细胞色素C，形成凋亡复合体，凋亡复合体的形成激活Caspase家族中的Caspase-9、Caspase-3等凋亡执行者，从线粒体途径诱发细胞凋亡，进而抑制SW细胞的增殖。此外，本实验发现熊果酸诱导细胞凋亡的作用优于GANT-61，说明在熊果酸诱导SW细胞凋亡的过程中，除Hedgehog信号通路参与外，其他通路也发挥了作用。因此，熊果酸通过综合调控包括Hedgehog信号通路在内的多种信号通路调控结直肠癌SW细胞的形态、生长、增殖、迁移，诱导其发生线粒体途径的凋亡，对临床上靶向癌细胞凋亡疗法和信号通路阻滞疗法具有重大意义。本实验结果为进一步研究Hedgehog信号通路靶点在结直肠癌治疗中的应用提供了有效参考，为熊果酸在癌症预防和治疗方面的应用提供了科学依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献：
来源：张梦，何曼，孙强，陈莉，曾沙，赵晖，杨寒，刘茂伦，任珊，徐海波．基于Hedgehog信号通路的熊果酸诱导结直肠癌SW细胞凋亡的机制研究[J].中草药,,52(8):-.
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