果胶酸钙和透明质酸修饰的大黄酸乳铁蛋白双 [复制链接]

摘要

在本文中，通过双靶向（肠上皮细胞和巨噬细胞）口服纳米递送策略组合大*酸（RH）在促进结肠粘液损伤修复和控制炎症反应中的双重生物响应，以有效治疗溃疡性结肠炎（UC）。简而言之，使用两种碳水化合物，果胶酸钙（CP）和透明质酸（HA）修饰乳铁蛋白（LF）纳米颗粒（NP）以包封RH（CP/HA/RHNP）。CP层使CP/HA/RHNPs更加稳定，防止胃肠环境的破坏性影响，然后将HA/RHNPs释放到结肠病变部位。细胞摄取评估证实NPs可以通过LF和HA配体特异性靶向并增强摄取速率。体内实验显示CP/HA/RHNPs通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路和加速结肠愈合显着减轻炎症。重要的是，在CP的帮助下，这项研究首次尝试将LF作为UC治疗中的靶向纳米材料，并在抗UC中提供了一种有前景的基于食品的纳米药物。

Introduction

1.介绍了UC，强调了现有药物的局限性和天然药物的优势。

2.介绍了大*素（RH）这是一种已经经过验证可以抗炎、从大*中提取的一种天然化合物。NF-KB是炎症主要的通路，所以说大*素可能和NF-kB通路密切相关。据报道其在一系列疾病如UC和IgA肾病期间对粘膜屏障具有保护作用。尽管有这些有希望的发现，但由于需要克服几个挑战，包括水溶性低、生物利用度有限和结肠靶向能力差，RH的临床应用在很大程度上受到限制。

3.一方面，透明质酸(HA)是靶向抗炎药物递送中最常用的阴离子多糖碳水化合物之一，其固有的能力是与炎症结肠中巨噬细胞表面过表达的CD44受体结合(Vafaei等人，年)。另一方面，乳铁蛋白(LF)，一种转铁蛋白家族的哺乳动物阳离子铁结合糖蛋白，可与LF受体结合(LFR)，在肠上皮细胞中高度表达(秋山等人，；罗乃尔、姜、杜，)。因此，与我们之前报道的其他蛋白质纳米载体(罗等人，)相比，LF具有特异性靶向肠上皮能力、食物来源和高包封率的优点，更适合负载药物治疗UC(Yadav等人，)。不幸的是，迄今为止，用于治疗溃疡性结肠炎的低频LF纳米载体很少被开发和研究。

4.对于口服治疗溃疡性结肠炎，低频纳米给药系统需要克服两个障碍，如胃中的不稳定性和对结肠病变的非特异性靶向能力。最近的研究表明，果胶，一种从植物初级细胞壁中获得的天然和食品级多糖碳水化合物，可以克服上述两种低频障碍。首先，果胶可以通过静电吸引与LF形成复合物，以增强LF在胃中的稳定性(Yuliarti，Lau，Wee，Kwan，)。果胶输送的唯一问题是其高水溶性，这阻碍了结肠靶向药物输送系统的制造，但是这个问题可以通过通过交联过程添加钙以形成果胶酸钙(CP)来解决(Chaurasia等人，)。第二，据报道，分布在结肠中的85-90%的肠道菌群可导致CP的特异性降解(程，*，*，；GunterPopeyko，)。因此，假设CP包被、透明质酸修饰的LF-NPs(CP/HA/RH-NPs)双靶向炎症和结肠粘膜损伤组织用于RH递送可能是一种用于UC的智能口服纳米药物递送(NDD)系统。

Result

Fig1

Fig2

有效的细胞摄取是负载RH的NP的治疗功效的主要要求。为了研究HA/LF功能化的NPs摄取特征，由于它们的HA受体和LFR高表达，分别使用两种细胞系Raw.7巨噬细胞和Caco-2细胞作为细胞模型（Lee，Sugihara，Gillilland，＆Jon），；Loennerdal等，）。此外，由于RH没有明显的荧光，我们使用C6作为荧光探针进行跟踪。根据体外NPs的释放研究结果，CP/HA/C6-NPs的CP层首先被肠道菌群降解，然后观察细胞释放的HA/C6-NPs摄取。因此，在没有肠道菌群相互作用的情况下，仅在HA/C6-NPs，C6-NPs和游离C6组中研究体外摄取分析，而在CP/HA/C6-NPs组中没有研究。通过FCM测量NP的定性分析以确认摄取功效并评估NP的摄取方式。对于Caco-2细胞，如图1和2所示。如图2A和B所示，随着浓度从6.25-ng/mL增加并且从0-4h增加时间，HA/C6-NPs中C6的荧光强度显着增强，表明HA/C6-NPs摄取时浓度和Caco-2细胞的时间依赖性。如图2C所示，将Caco-2细胞与C6浓度为ng/mL的游离C6，C6-NPs或HA/C6-NPs孵育4小时后，C6-NPs或HA的荧光强度/C6-NPs显着强于游离C6（p0.01）。然而，C6-NPs和HA/C6-NPs之间的荧光强度没有显着差异。相反，当C6-NPs或HA/C6-NPs暴露于与游离LF预孵育的Caco-2细胞时，其预先与Caco-2细胞表面上的受体位点结合，细胞内荧光显着降低（p0.01；图2D）。这些结果支持LF在特异性结合LFR中促进细胞内摄取治疗剂的积极作用的建议。在Raw.7巨噬细胞中也观察到相同的浓度和时间依赖性结果（图2E和F）。相反，如图2G所示，与游离C6，C6-NPs和HA/C6-NPs分别孵育4h后，HA/C6-NPs荧光强度明显增强，其次是C6-NPs和游离C6（p0.01）。有强有力的证据支持HA对提高Raw.7巨噬细胞对HA/C6-NPs的摄取率的贡献。结果还可以通过图2H进一步证实。在预先将Raw.7巨噬细胞与游离HA预孵育后，与没有HA孵育的HA/C6-NPs组相比，HA/C6-NPs的荧光强度迅速降低（p0.01）。所有结果表明，用LF或HA进行表面功能化可分别促进Caco-2细胞或Raw.7巨噬细胞对NPs的细胞摄取效率。

Fig3

Fig4

Fig5

Fig6

Fig7

Fig8

Fig9

结论

（1）CP层：根据胃稳定性和释放曲线评价的体外研究结果，在CP的帮助下，CP/HA/RHNPs显示出良好的胃稳定性，并且在大鼠盲肠内容物刺激下经历了受控的HA/RHNPs释放丰富的肠道菌群。重要的是，在体内靶向递送研究中，结果表明CP/HA/IRNPs表面的CP可以帮助LF提前不暴露于正常肠段周围，并进一步强烈暴露并靶向结肠病变周围。

（2）HA层：HA修饰的NP可以通过CD44介导的内吞作用途径靶向巨噬细胞以增加巨噬细胞的摄取速率，这在定性和定量分析的摄取评估研究中得到证实。此外，这种巨噬细胞靶标设计可以通过TLR4/MyD88/NF-κB途径在体内抗UC治疗功效中有效促进RH的抗炎作用。

（3）LF层：LF是一种常见的纳米载体，具有丰富的来源和良好的载药能力，对RH的包封率高（95.08%）。此外，本研究强调并证实LF被用作靶向肠上皮细胞的配体。通过LFR并增加Caco-2细胞的摄取率。该设计通过结肠上皮细胞靶标调节UC小鼠模型中的ZO-1和Claudin-1表达来增强RH在修复肠损伤中的作用。这项研究是第一次尝试将LF作为UC治疗中的靶向纳米材料。

与其他口服给药NDD相比（Gou等，；Lee等，；Xiao等，a），除了前面提到的智能纳米结构设计外，还需要指出三个进一步的优点。首先，NPs中的所有纳米材料，如CP，LF和HA，都是食品级和环保型的，其*性远低于其他合成化学纳米材料（Vong，Tomita，Yoshitomi，Matsui，＆Nagasaki，；Zhaoetal。，）。此外，NP的制备方法相对简单且易于按比例放大，并且药物和聚合物相对便宜且可大量获得。其次，大多数口服纳米药物递送系统仅靶向一个位点或一种类型的细胞，本研究基于不同的UC治疗机制同时针对两种不同的细胞提供了一种新的策略。第三，我们以前观察到RH可以抑制促炎细胞因子的表达水平，包括TNF-α，IL-6，IL-1β和iNOS，并改善DSS诱导的小鼠结肠炎，并首先证实了RH的抗炎作用。通过本研究中的TLR4/MYD88/NF-κB途径。